Nature Methods：肿瘤干细胞分离新方法[创新技巧]

生物通报道：近年来科学家们提出了肿瘤干细胞（癌症干细胞）的假说，认为在所有的细胞中，只有很小一部分细胞具有形成并维持肿瘤生长和异质性的能力，这一小部分细胞被称作肿瘤干细胞。

虽然目前一些科学家们对肿瘤干细胞假说存在争议，但是由于这种假说为癌症的治疗方法提供了新的思路——传统治疗忽略了这部分细胞，即使其他大部分肿瘤细胞都被消灭，但肿瘤仍然会面临着复发的可能，因此全球许多实验室都在聚焦这方面的研究。

这个假说中另外一个被科学家们普遍接受的方面就是肿瘤中的所有细胞地位并不均等，部分细胞比其它细胞更能引起肿瘤发生、维持肿瘤生长、保持肿瘤异质性（无论是否被称为肿瘤干细胞），因此研制出鉴别这种肿瘤起源细胞并将它们从早期肿瘤中分离出的方法，也是科学家们关注的焦点之一。

来自日内瓦大学（University of Geneva），日内瓦大学医院，洛桑联邦理工学院(Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne) 等处的研究人员发明了一种新方法，能无需生物标记物就能分离出肿瘤干细胞。这对于肿瘤干细胞的机理研究，以及病理治疗具有重要的意义。这一研究成果公布在新鲜出炉的《Nature Methods》杂志上。

虽然研究表明肿瘤干细胞的特征之一是维持神经胶质瘤的生长，但是一般用到的生物标记物，比如CD133由于缺乏足够的特异性，而不能识别这些细胞。在这篇文章中，研究人员报道了一种基于胶质瘤起源细胞（glioma-initiating cells，GIC）表型特征的新方法，这种方法无需标记，就能分离出肿瘤干细胞。

这种方法即自体荧光检测法（autofluorescent，生物通译），利用神经胶质瘤起源细胞天然的自身荧光和不同的形态学特征，可以从人类的神经胶质瘤中反复提取出这种细胞。在这篇文章中，研究人员就利用这种方法从人类胶质瘤和胶质瘤培养物中分离到了FL1+。

肿瘤干细胞研究的首要问题就是分离鉴定，但是由于缺乏特异的表面标记，肿瘤干细胞的分离纯化一直是长久以来各国科学家亟待解决的难题之一。近年来陆续也发展了一些新方法，比如流式细胞仪分选SP(side population)细胞方法，这种方法由于SP(side population)细胞富含干细胞样细胞, 并且SP细胞具有较明确的表型标记和分离方法，因此有许多科学家也通过流式细胞仪分选SP细胞的方法进行肿瘤干细胞的分离。

然而SP细胞分选方法也存在自身局限性，主要表现在两个方面：第一个方面就是SP细胞不能完全体现干细胞的特性，虽然大量研究证据表明SP细胞与干细胞的分子表型和特性具有一致性，但另外一些试验也存在不同观点，如Triel et al的实验表明并非从所有组织分离出来的SP细胞都具有干细胞的特性。因此，干细胞特异性分子标记物的研究是今后要着重解决的关键问题之一，可以与SP细胞的研究互为完善和补充。其次就是SP细胞分选过程中所使用荧光染料的毒性问题。

因此要解决这些问题，还需要更加多的新方法来帮助科学家们分离肿瘤干细胞。FL1+细胞在体外能自我更新，在体内具有肿瘤干细胞的特征，而且能优先表达干细胞基因。另外FL1+表型与GIC一般标记物的表达没有关联。研究人员证明利用FL1+细胞，新方法能检测出胶质瘤中的肿瘤起源细胞，这对于癌症新治疗方法和诊断具有重要意义。

荧光检测有两种原理，一种是物质要先经过荧光色素染色，才会产生荧光现象，另外一种是受激发光照射时，物质本身能发荧光，叫做自体荧光。自1924年Policard首先在实验中观察到了肿瘤组织的自体荧光以来, 荧光光谱技术在肿瘤中的应用日益发展起来。

自体荧光的机理是当低功率的激光照射人体组织表面, 组织中的原子或分子吸收光后会被激发到激发态, 停止激发后, 处于激发态的原子和分子通过能量驰豫过程返回基态时会发出光，由于人体不同组织的生化组成和形态结构不同, 因而不同的组织具有独特的光学特性和光谱特征。

在这篇文章中，研究人员将自体荧光与不同的形态特征结合了起来，检测具有体外自我复制，体内肿瘤起源功能的胶质细胞，这种方法无需利用分子标记，主要依赖于肿瘤遗传学相关的一般表型特征，是一种识别胶质起源细胞的简单方法，而胶质起源细胞则对于我们理解肿瘤生长的分子机理具有重要意义。

下图是研究人员获得自体荧光发光的胶质瘤和细胞培养物，从a图（胶质瘤培养物初级多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme）FACS分析）上可以看到，FL1检测的自体荧光（波长为515±5nm 或者530±15nm）等；b图为活体胶质瘤（初级GBM-17）双光子成像；c图为GBM-16细胞FACS分析；d图为单个FL1+从胶质组织中分离出来的共焦成像；e图中，不同干细胞培养基中次级GBM-1细胞的FACS分析。

这些研究数据表明，能自我更新和具有肿瘤起源性质的胶质瘤细胞有不同的形态学特征和自体荧光特征，从而科学家们能从非肿瘤性胶质瘤细胞中识别和分离出来，并且无需CD133的帮助。这种新方法可以从人类神经胶质瘤中分离出了肿瘤起源细胞，这对于肿瘤干细胞的机理研究，以及病理治疗具有重要的意义。

但是科学家们也指出，目前他们还不了解这些细胞自体荧光的分子机理，因此还需要更进一步的研究探索，不仅是分析在分离和研究神经胶质瘤启动细胞的标准方法之外，是否还有其它的可行方法，而且还要探明，这种方法是否适用于其它类型的肿瘤干细胞。

（生物通：张迪）

原文摘要：

Marker-independent identification of glioma-initiating cells

Tumor-initiating cells with stem cell properties are believed to sustain the growth of gliomas, but proposed markers such as CD133 cannot be used to identify these cells with sufficient specificity. We report an alternative isolation method purely based on phenotypic qualities of glioma-initiating cells (GICs), avoiding the use of molecular markers. We exploited intrinsic autofluorescence properties and a distinctive morphology to isolate a subpopulation of cells (FL1+) from human glioma or glioma cultures. FL1+ cells are capable of self-renewal in vitro, tumorigenesis in vivo and preferentially express stem cell genes. The FL1+ phenotype did not correlate with the expression of proposed GIC markers. Our data propose an alternative approach to investigate tumor-initiating potential in gliomas and to advance the development of new therapies and diagnostics.

附：

肿瘤干细胞研究尚未解决的科学问题

目前已有不少报道，但仍有不少科学与技术问题尚未解决。

肿瘤干细胞形成是否还有“演进”(progression)问题，尤其是突变的进一步积累恶性肿瘤发生发展被公认是一个多步骤的过程。包括它的生长能力、侵袭与转移、对药物的抗性等。这种多步骤的过程，可能反映了癌细胞发生与获得的突变的积累过程。长期以来，“两次打击”学说被认为是癌变最基本的条件，但癌变后，从癌的形成到癌的转移，究竟发生多少次突变，尚无定论；由于人体癌细胞大多属多倍体，癌细胞基因组高度不稳定，因此其突变的基因数，甚至个体差异均属未知数。对于某一个体的某一种组织发生的恶性肿瘤的癌干细胞究竟多少个基因发生了突变，以及癌干细胞在癌发展过程中，是否继续发生基因突变与积累而导致癌的“演进 ”，目前尚无实验证据。由于所报道的各种恶性肿瘤的癌干细胞均无造成此背景的叙述，该问题目前尚无法给予解释。

肿瘤非干细胞是否可能逆向转化为癌干细胞，非干细胞是否可逆向转化为干细胞。这是尚存在争议的问题。尽管大多数人认为分化细胞不能逆分化为干细胞，但仍有一些报道提示这种逆向分化在特定条件下是可能的：Tsuji-Takayama 等[35]用5-氮杂胞嘧啶核苷(5-azacytidine, 5-AzaC)使小鼠胚胎已分化细胞逆分化(reverse differentiation)成为具有细胞－细胞间界限不太明显的干细胞样形态结构的细胞，而且这些逆转细胞获得部分干细胞标志物阳性表型；von Melchner 等[36]用在全反式维甲酸(all-transretinoic acid)存在的人胎盘条件性培养基(半固体培养基)上连续传代，使人前髓细胞性白血病细胞(HL-60)逆转为重新获得增殖潜能而末端分化(HL-60原来可还原四唑硝基蓝NBT 的活性)特征消失的细胞，但迄今为止实体瘤的癌干细胞尚无此类研究报道。